“Mislukt” experiment met DNA-schaar blijkt toch geknipt voor publicatie

Een wetenschappelijk artikel van Utrechtse farmaceutische onderzoekers over het gericht afleveren van de “DNA-schaar” CRISPR-Cas9 trekt veel aandacht van vakgenoten. Sinds de publicatie in februari dit jaar werd het artikel al relatief vaak aangehaald in wetenschappelijke publicaties. De reden? Niet het experiment met de gewenste uitkomsten dat ook in het artikel wordt beschreven, maar juist het andere experiment met uitkomsten die onverwachts en desastreus waren voor de proefdieren. Groepsleider Enrico Mastrobattista: “Eindelijk worden deze negatieve resultaten eens een keertje naar buiten gebracht, want het voorkomt dubbel werk en onnodig leed bij proefdieren.”

Mastrobattista en zijn team onderzoeken hoe minuscule vetbolletjes gebruikt kunnen worden om medicijnen precies daar in het lichaam af te leveren waar ze nodig zijn. Deze kleine vetbolletjes, ook wel lipide nanodeeltjes genoemd, kunnen ook ingezet worden om CRISPR-Cas9 op de juiste plaats af te leveren.

DNA-schaar

CRISPR-Cas9 is van oorsprong een verdedigingsmechanisme van bacteriën, waarmee bacteriën virussen onschadelijk kunnen maken. CRISPR-Cas9 werkt als een soort schaar die het DNA op specifieke plaatsen in tweeën knipt. Cas9 is een enzym dat het DNA daadwerkelijk knipt, terwijl een kort RNA-molecuul gebonden aan het Cas9-enzym, het zogenaamde guide-RNA, bepaalt waar die knip precies plaatsvindt.

Het is ook belangrijk om resultaten te delen als iets niet werkt, want dat scheelt een hoop dubbel werk, tijd en geld. Bovendien bespaart het een hoop leed bij proefdieren.

De CRISPR-Cas9-technologie kan ingezet worden om het DNA van levende wezens heel precies aan te passen. Daarmee heeft het een grote impact op onder andere de geneeskunde. Zo heeft de CRISPR-Cas9-technologie de potentie om genetische aandoeningen te genezen. Specifieke genen die coderen voor ziekmakende eiwitten kunnen opgespoord en uitgeschakeld worden. Daarnaast is het zelfs mogelijk om de DNA-volgorde op een specifieke plek aan te passen, en dus bijvoorbeeld een gemuteerd gen dat een ziekte veroorzaakt te corrigeren.

RNA of eiwit

De techniek is niet perfect. Het Cas9-enzym knipt soms ook op andere plekken in het DNA dan de beoogde plek. Deze ongewenste knipreacties, ook wel off-target-effecten genoemd, moeten zoveel mogelijk voorkomen worden. Dit kan door het guide-RNA te optimaliseren, maar ook door de verblijftijd van het Cas9 in de cel zo kort mogelijk te houden en alleen actief te laten zijn in die cellen waar het nodig is.

Het motiveerde mij als jonge wetenschapper om te zien dat negatieve data toch leerzaam kunnen zijn.

Dat laatste kan in potentie met nanodeeltjes. De precieze inhoud van de nanodeeltjes is daarbij heel belangrijk voor hoe lang CRISPR-Cas9 actief is. Mastrobattista: “Er zijn twee manieren om CRISPR-Cas9 te bezorgen: via eiwitten en via boodschapper-RNA, ook wel mRNA genoemd. Wanneer je mRNA gebruikt is het geheel ongeveer vijf tot zeven dagen actief, bij eiwit maar een paar uur. In principe is eiwit dus een stuk veiliger, omdat de kans op off-target-effecten afneemt.”

Sterke immuunreactie

In de studie die nu zoveel aandacht krijgt, bekeek onderzoeker Johanna Walther hoe goed CRISPR-Cas9 in staat is om in de lever van muizen een bepaald gen uit te schakelen. Dit soort complexe experimenten waarbij gekeken wordt naar hoe nanomedicijnen getransporteerd en opgenomen worden door cellen, kunnen eigenlijk alleen in proefdieren bestudeerd worden, omdat de proefdiervrije modelsystemen nog niet adequaat genoeg zijn. De toenmalige promovenda van Mastrobattista vergeleek het effect van een behandeling met lipide nanodeeltjes gevuld met eiwit met het effect van een behandeling met nanodeeltjes gevuld met mRNA.

De met eiwit gevulde nanodeeltjes bleken niet veiliger te zijn. Integendeel. Mastrobattista: “De muizen die de behandeling met eiwit kregen, gingen geheel onverwachts allemaal binnen twee dagen dood. We moeten nog goed uitzoeken wat precies de oorzaak was, maar het lijkt erop dat het immuunsysteem sterk geactiveerd werd, waardoor de muizen een septische shock kregen.”

Publicatiebias

Het onderzoek leverde ook positieve resultaten op: de met mRNA gevulde nanodeeltjes bleken goed te werken en het beoogde gen uit te schakelen in zestig procent van de levercellen. Daarbij bleven alle met mRNA behandelde muizen in leven en werden er geen negatieve gezondheidseffecten van de behandeling gevonden. Mastrobattista: “Anderen hebben vergelijkbare positieve resultaten al wel eerder laten zien. De populariteit van het artikel komt in mijn optiek door de negatieve resultaten die eindelijk eens een keertje naar buiten worden gebracht.”

Mastrobattista vertelt dat hij de resultaten onlangs ook presenteerde op een congres. Daar werd hij door verschillende mensen aangesproken die vertelden vergelijkbare negatieve resultaten te zien bij hun experimenten, alleen had niemand zulke resultaten ooit gepubliceerd. “Daar zie je de zogeheten publicatiebias, waarbij alleen geslaagde experimenten gedeeld worden. Maar het is ook belangrijk om resultaten te delen als iets niet werkt, want dat scheelt een hoop dubbel werk, tijd en geld. Bovendien bespaart het een hoop leed bij proefdieren.”

We zien mogelijke oplossingen om toch met eiwit te kunnen werken, wat wenselijk is omdat het in potentie veiliger is.

Negatieve resultaten

Publicatiebias ontstaat doordat onderzoekers zelf hun negatieve resultaten niet delen, of omdat tijdschriften deze resultaten niet geschikt achten voor publicatie. Mastrobattista weet waarom de negatieve resultaten dit keer wel gepubliceerd konden worden: “We hadden ook positieve resultaten. Dat gaf vertrouwen dat het experiment goed was uitgevoerd.”

Johanna Walther werkt tegenwoordig als projectleider bij het Nederlands Kanker Instituut. Walther: “Ik heb het altijd gewaardeerd dat Enrico een promotor is die het publiceren van negatieve data aanmoedigt. Het motiveerde mij als jonge wetenschapper ook om te zien dat negatieve data toch leerzaam kunnen zijn. De dood van de muizen was verdrietig, maar het was ook een duidelijk boodschap die gedeeld moest worden.”

Verder onderzoek

Ondanks de resultaten blijft Mastrobattista niet bij de pakken neerzitten. “CRISPR-Cas9 is van oorsprong bacterieel, dus het is logisch dat het immuunsysteem daarop reageert. We zien mogelijke oplossingen om toch met eiwit te kunnen werken, wat wenselijk is omdat het in potentie veiliger is. Misschien was het gebruikte eiwit niet helemaal zuiver, wat tot een sterke reactie leidde. We zouden ook het eiwit zo aan kunnen passen zodat het niet zo’n sterke afweerreactie oproept, maar nog wel goed werkt.”